1、这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。荧光定量PCR的优点： 可进行准确的定量检测。用于基因诊断。 定量范围宽。 特异性更强，克服了假阳性。 操作简单快速，无须后处理和电泳检测。 安全，技术易于学习，易于进行电脑化数据管理。
2、因为基本每个样本都是三个复孔，所以用目的基因CT平均减去内参的平均，再算其2-△△CT，EXCEL即可。
3、在数据收集完毕后，frax的智能软件大显身手。它运用特殊算法，对数据进行正常化处理，巧妙地校正背景荧光的干扰，确保分析结果的准确性。这样，每一个实验结果都能被精准地定位在统一的分析域值水平上。
4、这张表格很好理解啊 不知道你是不清楚什么，这张表格指的是反转录PCR以及荧光定量PCR时一些基因的引物序列，F是上游引物，R是下游引物，其中还包含一些管家基因序列，以后设计引物的时候可以用到。
现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
如果是做的相对定量，用CTmean的结果就可以了，计算方法就是R＝2-ΔΔCt，现在很多仪器你只要设置的时候明确标出内参基因和目的基因，这个结果也是会有自带软件给计算出来的。
模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，荧光定量PCR（ qPCR）由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
数据分析基线数据分析基线数据分析基线数据分析基线数据分析阈值线数据分析阈值线常见问题分析PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例）扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在扩增抑制；解决方法：将样本稀释后进行扩增。
根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。
你一次实验做的数据，内参可以得到几个CT值，目的基因也会得到几个。这样的话，根据平均的CT值，就会得到一个倍数（相对量）。 实验肯定不会只做一次吧，至少重复3次以上。这样就会得到3个以上的倍数了。3个以上的数值就可以算均数和标准差了。
如果是做的相对定量，用CTmean的结果就可以了，计算方法就是R＝2-ΔΔCt，现在很多仪器你只要设置的时候明确标出内参基因和目的基因，这个结果也是会有自带软件给计算出来的。
看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。
实时荧光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR） 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
如果有标准曲线，按照标准曲线计算。一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin）CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
Sybergreen可以和所有核酸结合，没有特异性。所以要保证特异性的话，最好用其他的方法。扩增体系中加入模板DNA的体积，比如同时10微升的体系，对照组加1微升DNA，实验组加2微升DNA，则实验组的加样量是对照组的2倍。
荧光定量PCR之后计算目的基因的相对表达量一般采用2-△△ct的方法。我们还是假设对照组和处理组各有三个生物学重复（即对照组3个cDNA样品cDNA1， cDNA2， cDNA3，处理组3个cDNA样品cDNA4， cDNA5， cDNA6），三个技术重复（即每个cDNA的每个基因点三个孔）。
相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异，也称之是2-DDCt。1绝对定量从标准曲线获得线性方程：Y=-432X+3638；R2=0.995，E=95%，所以可以进行数据分析。
相对的话你需要一个对照，一般就是指内参。首先选取对照组的内参作为标准的100%表达水平，然后拿实验组的表达量比对照组表达量再乘以实验组内参表达量比对照组内参表达量。
相对表达量，就是一个基因在处理组中的表达量相对于对照组的表达量。一般情况下，一个基因的相对表达量是根据这个基因相对内参基因的表达倍数计算的，然后在把处理组中该基因相对表达量与对照组的相对表达量相除，就得出了relative expression值。
一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin）CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A： delta CT=20-18=2。2的2次方是4。
对照不一定是1，如果你只是计算每个样本或者基因的表达量，那就不一定是1了。
1、首先建议生物学重复和技术重复保证三个左右，如果样本只有两个donor，可以将两者混匀后作为第三个样本。三个技术重复可以更加确保你数据的准确性。－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。
2、学习做Realtime PCR， 实验结果是出来了，得到的内参、目的基因的Ct 值在15-25 之间，熔 融曲线基本上也是单峰，但不太会处理这个结果，对着数据发愁.不同的处理方法得到不 同的结果. 做的是相对定量，SYBR Green， 选用2^（-△ △ Ct）法 内参基因：对照。
3、我的实验是去医院收样本来做的，一次收不了几个，所以用荧光PCR做相对定量只能分很多次做，这样我要最后把数据集中起来就没有办法直接用仪器给出的图表，而且有些数据我也还要筛选一下。
4、同时做最好，分开几次上机会增加误差，一般都是能在一块板上完成就一次完成。
